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Gesamtplanung des PCR-Reinigungslabors

Jul 22, 2020

Um eine Kreuzkontamination während des Betriebs zu vermeiden, sind die Hauptanforderungen für Design, Konstruktion und Betriebsmanagement:


1. Das Design und die Konstruktion des Labors, das sichere Arbeitssystem oder die Betriebsverfahren nach Sicherheitsstandards müssen den Anforderungen des aktuellen&"Allgemeine Anforderungen an die Laborbiosicherheit GG" entsprechen. GB19489.


2. Die PCR ist gemäß den Arbeitsschritten in vier Funktionsbereiche unterteilt, nämlich Reagenzienlager- und -vorbereitungsbereich, Probenvorbereitungsbereich, Amplifikationsbereich und Amplifikationsproduktanalysebereich. Wenn ein Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Instrument ausgestattet ist, können die Bereiche Amplifikation und Produktanalyse kombiniert werden. Jeder Funktionsbereich muss deutlich gekennzeichnet sein und Geräte und Artikel in verschiedenen Funktionsbereichen dürfen nicht gemischt werden.


Die Luftströmungsrichtung des PCR-Labors kann gemäß dem Reagenzienlager- und -vorbereitungsbereich → Probenvorbereitungsbereich → Amplifikationsbereich → Bereich der amplifizierten Produktanalyse durchgeführt werden, um zu verhindern, dass die amplifizierten Produkte zusammen mit dem Luftstrom in den voramplifizierten Bereich gelangen. Es kann so durchgeführt werden, dass der Luftdruck aus dem Reagenzienlager- und -vorbereitungsbereich → Probenvorbereitungsbereich → Amplifikationsbereich → Amplifikationsproduktanalysebereich verringert wird. Dies kann durch die Installation von Abluftventilatoren, Unterdruck-Abgasvorrichtungen oder anderen praktikablen Methoden erreicht werden.


3. Das Betreten jedes Arbeitsbereichs sollte streng nach einer einzigen Richtung erfolgen, dh Reagenzienlager- und -vorbereitungsbereich → Probenvorbereitungsbereich → Amplifikationsbereich → Amplifikationsproduktanalysebereich. Es sollten unterschiedliche Arbeitsbereiche (z. B. unterschiedliche Farben) verwendet werden. Die Arbeitnehmer dürfen keine Arbeitskleidung ausziehen, wenn sie jeden Arbeitsbereich verlassen.


4. Die Reinigung des Labors sollte in Richtung des Reagenzienlager- und -vorbereitungsbereichs → Probenvorbereitungsbereich → Amplifikationsbereich → Bereich der amplifizierten Produktanalyse erfolgen. Verschiedene Versuchsbereiche sollten über eigene Reinigungsgeräte verfügen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.


5. Nach Beendigung der Arbeit muss der Arbeitsbereich sofort gereinigt werden. Die Oberfläche des Labortisches im Arbeitsbereich sollte den Desinfektions- und Reinigungseffekten von Chemikalien wie Natriumhypochlorit standhalten. Die ultraviolette Bestrahlung der Oberfläche des Labortisches sollte bequem und effektiv sein. Da der Abstand und die Energie der ultravioletten Bestrahlung für den Dekontaminationseffekt sehr kritisch sind, kann eine bewegliche ultraviolette Lampe (Wellenlänge 254 nm) verwendet werden, und nach Abschluss der Arbeiten kann sie so eingestellt werden, dass sie auf dem Versuchstisch innerhalb von 60 bis 90 cm bestrahlt wird . Da das amplifizierte Produkt nur einige hundert oder zehn Basenpaare (bp) enthält, ist es nicht empfindlich gegenüber UV-Schäden, so dass das UV-bestrahlte amplifizierte Fragment für eine längere Zeit, vorzugsweise über Nacht, bestrahlt werden muss.


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Die Funktionen des Reagenzienlager- und -vorbereitungsbereichs sind: die Herstellung von Lagerungsreagenzien, die Abgabe von Reagenzien und die Herstellung des Amplifikationsreaktionsgemisches sowie die Lagerung und Vorbereitung von Verbrauchsmaterialien wie Zentrifugenröhrchen und -spitzen. Materialien wie Speicherreagenzien und Verbrauchsmaterialien, die für die Probenvorbereitung verwendet werden, sollten direkt zum Lager- und Vorbereitungsbereich für Reagenzien transportiert werden und dürfen den Amplifikationsnachweisbereich nicht passieren. Die im Kit enthaltenen Positivkontrollmaterialien und Qualitätskontrollmaterialien sollten nicht in diesem Bereich, sondern in diesem Bereich aufbewahrt werden. Probenverarbeitungsbereich.


Die Funktion des Probenvorbereitungsbereichs ist: Extraktion, Lagerung und Zugabe von Nukleinsäure (RNA, DNA) zum Amplifikationsreaktionsröhrchen. Bei Operationen mit klinischen Proben sollten die Anforderungen an Schutzausrüstung, Personenschutz und Betriebsspezifikationen für Sekundärlabors für biologische Sicherheit erfüllt sein. Da beim Mischen der Probe und bei der Reinigung der Nukleinsäuren eine Kontamination durch Aerosole auftreten kann, können in diesem Bereich Überdruckbedingungen hergestellt werden, um eine Kontamination des Aerosols durch benachbarte Bereiche zu vermeiden. Um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben zu vermeiden, muss nach Zugabe der zu testenden Nukleinsäure das Reaktionsrohr mit dem Reaktionsgemisch abgedeckt werden. Bei potenziell infektiösen Materialien muss der Deckel in der biologischen Sicherheitswerkbank geöffnet werden und es müssen klare Verfahren für die Handhabung und Inaktivierung der Proben vorhanden sein.


Die Funktion der Amplifikationszone ist: DNA-Synthese, DNA-Amplifikation und Nachweis. Um eine durch Aerosole verursachte Verschmutzung zu vermeiden, sollte das Gehen in der Umgebung minimiert werden. Es ist zu beachten, dass in diesem Bereich nicht alle getesteten Reaktionsröhrchen geöffnet werden dürfen.


Die Funktion des Bereichs der amplifizierten Produktanalyse ist: weitere Analyse und Bestimmung von amplifizierten Fragmenten wie Hybridisierung, Enzymverdauungselektrophorese, Denaturierung von Hochleistungsflüssigkeitsanalysen, Sequenzierung usw. Nukleinsäureamplifikationsprodukte verfügen über verschiedene Analysemethoden, wie z. B. Sondenhybridisierungsmethoden auf Membranen oder auf Mikroplatten oder Chips (Radionuklidmarkierung oder nicht radioaktive Nuklidmarkierung), direkte oder verdaute Agarosegelelektrophorese, Polyacrylamidgelelektrophorese, Southern-Transfer, Nukleinsäuresequenzierungsmethoden, Massenspektrometrie usw.


Der Bereich zur Analyse des Amplifikationsprodukts ist die Hauptquelle für die Kontamination des Amplifikationsprodukts im PCR-Labor. Daher sollte darauf geachtet werden, dass das Amplifikationsprodukt nicht durch die Artikel und Arbeitskleidung in diesem Bereich transportiert wird. Bei Verwendung der PCR-ELISA-Methode zum Nachweis amplifizierter Produkte muss ein Plattenwäscher zum Waschen der Platten verwendet werden, und die Abfallflüssigkeit muss in 1 mol / l HCl gesammelt werden und kann nicht im Labor gegossen werden, sollte jedoch weggeworfen werden aus dem PCR-Labor. Fallen. Die gebrauchte Spitze muss auch in 1 mol / l HCl eingeweicht und dann zur Entsorgung gemäß Verfahren wie Verbrennung in einen Müllsack gelegt werden. Da in diesem Bereich möglicherweise bestimmte genetische Mutationen und toxische Substanzen wie Ethidiumbromid, Acrylamid, Formaldehyd oder Radionuklide usw. verwendet werden, sollte der Sicherheitsschutz der Experimentatoren beachtet werden.